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液相色譜儀的日常應用原理
發布時間:2012-11-09   點擊次數:3335次
  液相色譜儀的原理
  
  液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統,下面將分別敘述其各自的組成與特點。
  
  1.進樣系統一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作,進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。
  
  2.輸液系統該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47~4.4X107Pa,流速可調且穩定,當高壓流動相通過層析柱時,可降低樣品在柱中的擴散效應,可加快其在柱中的移動速度,這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀,可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變,包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值,或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(即使僅有一個基團的差別或是同分異構體)都能獲得有效分離。
  
  3.分離系統該系統包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10~50cm(需要兩根連用時,可在二者之間加一連接管),內徑為2~5mm,由"不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成,住內裝有直徑為5~10μm粒度的固定相(由基質和固定液構成).固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成,它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達1000?)和比表面積大的特點,加之其表面經過機械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣),或者用化學法偶聯各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機化合物。因此,這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如,在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
  
  另外,固定相基質粒小,柱床極易達到均勻、致密狀態,極易降低渦流擴散效應。基質粒度小,微孔淺,樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據柱效理論分析,基質粒度小,塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小,會提高分辨率的道理。再者,液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60C,通過改善傳質速度,縮短分析時間,就可增加層析柱的效率。
  
  液相色譜儀應用過程中常見問題解析
  
  1.液相色譜儀系統
  
  液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進樣器、柱子、柱溫箱、檢測器、數據處理系統組成。對于整個系統而言,柱子、泵和檢測器是核心部件同時也是易出問題的主要部位。
  
  2.常見問題及解決方法
  
  液相作為一種高精密儀器,如果在使用過程中不按照正確操作的話,就容易導致一些問題。其中zui常見的就是柱壓問題、漂移問題、峰型異常問題。
  
  2.1柱壓問題
  
  柱壓問題是使用液相色譜過程中需要密切注意的地方,柱壓的穩定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時間等密切相關。所謂柱壓穩定并不是指壓力值穩定于一個恒定值而是指壓力波動范圍在50PSI(3.3Bar)之間(在使用梯度洗脫時,柱壓平穩緩慢的變化是允許的)。壓力過高、過低都屬于柱壓問題。
  
  2.1.1壓力過高
  
  這是液相在使用中zui常見的問題,指的是壓力突然升高,一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時,我們應該分段進行檢查。
  
  (1).首先斷開真空泵的入口處,此時PEEK管里充滿液體,使PEEK管低于溶劑瓶,看液體是否自由滴下,如果液體不滴或緩慢滴下,則是溶劑過濾頭堵塞。處理方法:用30%的硝酸浸泡半個小時,在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下,溶劑過濾頭正常,在檢查;
  
  (2).打開Purge閥,使流動相不經過柱子,如果壓力沒有明顯下降,則是過濾白頭堵塞。處理方法:將過濾白頭取出,用10%的異丙醇超聲半個小時。如果壓力降至100PSI(6.7Bar)以下,過濾白頭正常,在檢查;
  
  (3).把色譜柱出口端取下,如果壓力不下降,則是柱子堵塞。處理方法:如果是緩沖鹽堵塞,則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強保留的物質導致堵塞,則要用比現在流動相更強的流動相沖至壓力正常。假如按上面的方法長時間沖洗壓力都不下降,則可考慮將柱子的進出口反過來接在儀器上,用流動相沖洗柱子。這時,如果柱壓仍不下降,只有換柱子入口篩板,但一旦操作不甚,很容易造成柱效下降,所以盡量少用。
  
  2.1.1壓力過低
  
  壓力過低的現象一般是由于系統泄漏,處理方法:尋找各個接口處,特別是色譜柱兩端的接口,把泄漏的地方旋緊即可。當然還有一個原因就是泵里進了空氣,但此時表現的往往是壓力不穩,忽高忽低,更嚴重一點會導致泵無法吸上液體。處理方法:打開Purge閥,用3~5ml/min的流速沖洗,如果不行,則要用專用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。
  
  液相色譜儀儀器各部分日常簡易保養及維護
  
  1、流動相的抽濾要求
  
  色譜純試劑,二次蒸餾水,緩沖鹽一定要過濾。
  
  2、吸濾頭
  
  特殊情況下可拆下濾頭抽取以判斷其中是否堵塞;亦可用注射器吸取流動相通過吸濾頭打出以判斷其是否堵塞。若有堵塞情況可用異丙醇超聲波清洗;清洗不成功則需要更換。
  
  3、單向閥
  
  如遇到泵壓不穩或流動相不能抽取,則可能是單向閥出現問題,卸下用異丙醇超聲波清洗,清洗時須按其安裝的反相放置在小燒杯中,切記不可與安裝方向倒置超洗!
  
  4、泵頭
  
  泵頭漏液或出現其它故障一般要申請維修(如漏液,或更換柱塞桿及其密封墊等)。
  
  5、過濾片
  
  當色譜峰出現異常情況時,有可能是此部件被污染,拆下用異丙醇超洗或更換過濾墊片。
  
  6、排液閥
  
  此處不能完全密封或漏液時一般是其中的墊片污染或磨損,可卸下后取出其墊片用異丙醇超聲波清洗或更換墊圈。
  
  7、手動進樣器
  
  平時應注意用二次蒸餾水和甲醇在裝載狀態及進樣分析狀態清洗;如出現漏液現象,原因極可能為轉子密封墊磨損或污染,一般須申請維修或更換配件。
  
  8、流通池
  
  在色譜峰不正常時可能是此部件被污染可拆卸后取出其中的墊片用異丙醇超洗(可根據說明書進行操作或申請維修)。
  
  9、工作站
  
  出現死機可重啟計算機;不正常運行時,首先可更換電腦測試其硬件故障;或在本機上重新插撥接口、重新安裝軟件。

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